Энциклопедия применений
Как наблюдать фотоконвертируемые флуоресцентные белки с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа?
Инвертированный флуоресцентный микроскоп в сочетании с флуоресцентными белками позволяет визуализировать органеллы в живых клетках. Для более точного мечения и отслеживания конкретных целевых клеток или отдельных областей требуются фотоактивируемые, фото-переключаемые или оптогенетически переключаемые флуоресцентные белки. Хотя для этого обычно необходим конфокальный микроскоп или микроскоп сверхвысокого разрешения, существуют способы наблюдать их с помощью обычного инвертированного флуоресцентного микроскопа (широкопольной флуоресценции). Вот пояснение:
- Фотоконвертируемые флуоресцентные белки
Фотоконвертируемые флуоресцентные белки в основном получены из кораллов
Этот фото-переключаемый флуоресцентный белок, меняющий цвет с зелёного на красный, получен из кораллов и назван Kaede (по-японски «кленовый лист») из-за сходства с осенними кленовыми листьями, меняющими цвет. Однако из-за ограничений свойств Kaede не является надёжным и удобным коммерческим красителем для живых клеток. Три основных фото-переключаемых флуоресцентных белка, обычно используемых в визуализации сверхвысокого разрешения, — это Dendra2, mEos2 и mKikGR.
Спектр флуоресценции Dendra2 лучше совместим с конструкцией стандартных блоков возбуждения.
Зачем использовать широкопольный флуоресцентный микроскоп?
Инвертированный флуоресцентный микроскоп исследовательского класса MF53-N (широкопольная флуоресценция)
Обычные флуоресцентные микроскопы, как правило, являются широкопольными. По сравнению с конфокальными микроскопами их разрешение по оси Z ниже. При большом увеличении на изображении появляются ореолы от расфокусированного возбуждения, что не позволяет получить флуоресцентное изображение с предельно резкими краями.
Однако наблюдение фото-переключаемых флуоресцентных белков с помощью флуоресцентного микроскопа имеет ряд преимуществ. Во-первых, стоимость флуоресцентного микроскопа значительно ниже, чем конфокального. Кроме того, он относительно прост и удобен в использовании, что делает его более доступным оборудованием.
При возбуждении длинноволновым УФ листья папоротника проявляют многоцветную флуоресценцию
Более того, в погоне за точностью конфокальные микроскопы обычно не могут одновременно наблюдать процесс конверсии во время операций фото-переключения. В отличие от них, конфигурация U-блока ультрафиолетового возбуждения во флуоресцентных микроскопах часто использует длиннопропускающие эмиссионные фильтры LP, которые позволяют одновременно отображать излучение от синего до красного диапазона волн, обеспечивая наблюдение процесса конверсии в реальном времени во время фото-переключения.
- Как наблюдать фотоконвертируемые флуоресцентные белки с помощью флуоресцентного микроскопа?
Инвертированный флуоресцентный микроскоп исследовательского класса MF43-N
Чтобы наблюдать фото-переключаемые флуоресцентные белки с помощью флуоресцентного микроскопа, необходимо иметь конфигурацию с многоцветными блоками возбуждения и полевую диафрагму в флуоресцентном оптическом тракте. Требуется U-блок возбуждения (блок возбуждения DAPI) с длиннопропускающей конфигурацией, что предполагает использование научно-исследовательского флуоресцентного микроскопа.
Connexin43-Dendra2 раскрывает динамику белка щелевых контактов Cx
Визуализация и подготовка до конверсии:
- Подготовка в тёмной комнате и адаптация глаз:Выключите свет, чтобы создать тёмную комнату и дать глазам адаптироваться к слабому освещению для оптимальной визуализации.
- Переключение на блок синего возбуждения:Выберите блок возбуждения 450–490 нм (синий), соответствующий зелёной флуоресценции до конверсии (например, Dendra2 при синем свете).
- Настройка интенсивности источника света:Светодиод: уменьшите яркость и временно выключите;Ртутная лампа: вставьте ND-фильтр и закройте затвор возбуждения (если есть)
- Переключение на объектив с большим увеличением:Поверните на масляный объектив 100X или 60X; нанесите иммерсионное масло для оптимального пропускания света.
- Установка подготовленного образца:Поместите образец (например, чашку со стеклянным дном с клетками, экспрессирующими фотоконвертируемый белок) на предметный столик и надёжно закрепите.
- Фокусировка клеток с помощью фазового контраста:Используйте фазовый контраст, чтобы найти и сфокусироваться на целевых клетках; отцентрируйте ROI для фотоконверсии.
- Включение источника возбуждения:Светодиод: включите и настройте подходящую интенсивность;Ртутная лампа: откройте затвор возбуждения (если закрыт)
- Съёмка зелёных изображений до конверсии:Оптимизируйте время экспозиции/усиление; сохраните чёткие зелёные флуоресцентные изображения как эталон.
- Переход на зелёное возбуждение для красной флуоресценции:Смените на блок зелёного возбуждения 500–550 нм; на этом этапе красная флуоресценция должна быть минимальной.
Dendra2-H2B показывает высокую стабильность гистона H2B
Наблюдение и визуализация фотоконвертированных флуоресцентных белков:
- Выравнивание фазового контраста. Отцентрируйте объект в поле зрения с помощью фазового контраста.
- Узкая полевая диафрагма. Уменьшите область флуоресцентного освещения с помощью полевой диафрагмы. УФ-опосредованная фотоконверсия.
- Переключитесь на УФ-возбуждение; увеличьте яркость LED/уберите ND-фильтр (для ртутной лампы). Наблюдайте конверсию из зелёного в красный через окуляр (отрегулируйте размер диафрагмы; время конверсии: 5-10 с в зависимости от интенсивности УФ).
- Переключитесь на блок синего (B) возбуждения, откройте полевую диафрагму, снимите зелёные флуоресцентные изображения, затем переключитесь на блок зелёного (G) возбуждения для красной флуоресценции — теперь должна быть видна отчётливая красная флуоресценция.
- Покадровая съёмка (time-lapse). Задайте интервальную съёмку для зелёного и красного каналов, чтобы отслеживать динамику клеток и белков.
Dendra2-α-тубулин отслеживает динамическую полимеризацию и деполимеризацию тубулина
Используя этот рабочий процесс, можно также наблюдать фотоактивируемые белки, FRET (флуоресцентный резонансный перенос энергии) и фотоуправляемые флуоресцентные белки, что очень удобно для преподавания и исследований на макроуровне.