В таких областях, как клеточная биология, иммунофлуоресценция и исследование опухолей, качественная флуоресцентная визуализация часто является ключом к раскрытию биологических явлений. Однако многие исследователи сталкиваются с проблемами визуализации в погоне за идеальными изображениями — либо флуоресцентный сигнал слишком слаб, либо чрезмерный шум скрывает ключевые сигналы.
Эти проблемы обычно связаны не с подготовкой образца или самим оборудованием, а вызваны несколькими критичными факторами настройки визуализации.
Сегодня мы поделимся пятью ключевыми моментами флуоресцентной визуализации. Освоив их, вы больше никогда не будете переживать из-за неудачных снимков уровня журнальной публикации!
1. Толщина образца/стекла
Предметные и покровные стёкла, а также срезы тканей не должны быть слишком толстыми. Толстые стёкла поглощают больше света и не позволяют возбуждающему свету правильно сфокусироваться на образце. Толстые срезы тканей могут вызывать наложение клеток или присутствие примесей, что мешает ключевым наблюдениям.
Рекомендации/советы:
- Толщина предметного стекла должна быть 0,8–1,2 мм, а покровного стекла — около 0,17 мм.
- Для усиления возбуждающего света можно использовать интерференционные покровные стёкла. Эти специальные покровные стёкла покрыты несколькими слоями материалов (например, фторида магния), которые интерферируют на разных длинах волн света, обеспечивая беспрепятственное прохождение флуоресценции.
2. Правильный подбор набора фильтров: ключевой фактор
Разные флуоресцентные красители имеют разные спектры возбуждения/эмиссии. Использование неподходящего набора фильтров по сути бессмысленно.
Рекомендации/советы:
- Проверьте спектральный диапазон красителя и подберите соответствующий набор фильтров (например, FITC: EX490/EM520 нм).
- Особенно для образцов с многоканальным совмещённым окрашиванием избегайте перекрытия спектров, чтобы минимизировать перекрёстные помехи.
3. Защита от тушения флуоресценции
Флуоресцентные сигналы часто затухают слишком быстро во время съёмки, обычно из-за тушения флуоресценции, вызванного воздействием света. Это не только влияет на качество изображения, но и может прерывать эксперименты и приводить к потере данных.
Рекомендации/советы:
- Используйте среду для заключения, содержащую DABCO или аналогичные антиоксидантные (anti-quenching) добавки.
- Старайтесь проводить весь процесс в темноте, особенно на этапах окрашивания, заключения и переноса.
- Сначала снимайте каналы, склонные к тушению (например, Cy5), затем более стабильные каналы, такие как DAPI.
4. Выбрали ли вы флуоресцентный объектив?
Флуоресцентный объектив, как следует из названия, предназначен специально для флуоресцентного наблюдения. Такие объективы используют флюоритовое стекло, обеспечивая лучшие оптические характеристики по сравнению со стандартными объективами и давая более яркие изображения с высоким контрастом.
Рекомендации/советы:
- Обратите внимание на числовую апертуру (NA) объектива: чем выше NA, тем лучше светособирающая способность и разрешение объектива. Для флуоресцентной визуализации выбирайте объектив с высокой NA.
5. Правильно ли вы выбрали источник флуоресцентного света?
Яркость и отношение сигнал/шум флуоресцентных изображений во многом зависят от силы и стабильности источника возбуждающего света. Неправильный выбор источника света может приводить к слабым сигналам, длительным экспозициям и усиленному тушению.
Рекомендации/советы:
- Отдавайте приоритет мощным светодиодным источникам света: по сравнению с традиционными ртутными или металлогалогенными лампами светодиодные источники имеют явные преимущества.
- Яркость и стабильность: Светодиодные источники мгновенно выходят на полную мощность и дают стабильный свет без постепенного снижения яркости, характерного для традиционных ламп, что обеспечивает воспроизводимость результатов экспериментов.
- Длительный срок службы и низкие затраты на обслуживание: Светодиоды работают десятки тысяч часов, значительно превосходя традиционные лампы, что снижает долгосрочные расходы на эксплуатацию и обслуживание.
- Быстрое переключение и гибкое управление: Светодиоды позволяют включаться и выключаться за миллисекунды, что идеально подходит для многопольной и многомоментной визуализации живых клеток, минимизируя ненужное облучение образца.
Рекомендации по продуктам
Инвертированный флуоресцентный микроскоп MSHOT MF53-N — классическая модель исследовательского уровня с превосходной оптической системой с бесконечной коррекцией и полуапохроматическим объективом с большим рабочим расстоянием. Он оснащён мощным светодиодным источником света MSHOT MG-100, охватывающим широкий спектр.
Микроскоп может комплектоваться различными светофильтрами (UV, V, B, G, Y, R) для наблюдения распространённых флуоресцентных красителей, таких как DAPI, FITC, TRITC и серии Alexa Fluor, широко применяемых в выявлении CTC, FRET и клеточной иммунологии. Обычно используется в университетских исследовательских лабораториях, научных институтах и клинических отделениях, таких как патология и лабораторная медицина.
Конструкция с 6-позиционной поворотной флуоресцентной насадкой обеспечивает быструю и точную смену фильтров, минимизируя перекрёстные помехи и повышая эффективность многоцветной визуализации. Стабильная оптическая конструкция гарантирует высокую согласованность съёмки.
The MG-150 — высокоэффективный долговечный флуоресцентный источник света, который в полосах возбуждения RGY обеспечивает более чем двукратную светоотдачу по сравнению с традиционными ртутными лампами.
- Мгновенное включение/выключение с 3 независимыми каналами для точной регулировки яркости (0-100% для УФ, B, Y каналов).
- Умная функция запоминания яркости для каждого канала, чтобы минимизировать тушение флуоресценции.
- Высокая совместимость с флуоресцентными микроскопами исследовательского класса ведущих брендов.
Реальный пример исследования
В недавнем исследовании гипертонии, опубликованном в Journal of Extracellular Vesicles, команда Китайского фармацевтического университета использовала инвертированный флуоресцентный микроскоп MSHOT MF53-N для визуализации миграции клеток, успешно раскрыв новые механизмы ремоделирования сосудов и определив потенциальные терапевтические мишени!
Качественные результаты флуоресцентной визуализации складываются из точной пробоподготовки, правильного подбора светофильтров, надёжной защиты от выцветания, высокопроизводительных объективов и стабильных источников возбуждения. Такие системы, как MSHOT MF53-N и MG150 объединяют эти ключевые элементы и обеспечивают стабильную и надёжную поддержку исследований высокого уровня в вашей лаборатории.
Мы уверены, что выдающиеся научные открытия начинаются с надёжных данных. Если вы хотите узнать больше об оптимизации вашей платформы флуоресцентной визуализации, свяжитесь с нами, чтобы получить индивидуальные решения и подробную техническую информацию под ваши экспериментальные задачи.